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凍干保護劑在蛋白藥物中起了什么作用

冷凍干燥廣泛用于制備治療性蛋白質制劑，蛋白凍干制劑可以提供更好的保質期，方便藥物的儲藏和運輸，然而，蛋白在凍干過程中存在許多應力，包括低溫應力、凍結應力(枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等)、干燥應力(失去蛋白質表面水分子)等，這些應力常常直接或間接導致蛋白質類藥物失去天然構象從而變性或失活。

冷凍干燥保護劑的分類方式很多，有文獻中提出了一個公式化模型，按照功能把冷凍干燥保護劑分類，包括5類:

①pH緩沖劑，如Tris、組氨酸、枸櫞酸等;

②配體，可以優(yōu)化蛋白質的熱力學穩(wěn)定性;

③穩(wěn)定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質的展開和提供玻璃基質起保護作用;

④非離子表面活性劑，可減少蛋白質的聚集;

⑤填充劑，如甘露醇、甘氨酸、***淀粉、血清白蛋白等，可提高產(chǎn)品的物理成型性。這里我們簡要介紹其中幾種。

1、緩沖鹽

首先，蛋白質穩(wěn)定性受環(huán)境pH的影響，緩沖液選擇在蛋白質制劑的開發(fā)過程中是最關鍵的，并且必須在配制階段建立。在選擇緩沖液pH時，建議pH不要太接近蛋白質的pI(等電點)以避免聚集。

磷酸鹽是蛋白質配方中最常見的緩沖劑之一，特別是含水蛋白質藥物，有效pH值范圍為5.8-8.0，并且具有生物相容性。然而，正如“冷凍過程中的pH變化"所討論的那樣，磷酸鹽緩沖液，特別是磷酸氫二鈉，在冷凍過程中會發(fā)生顯著的pH變化，因此不推薦用于pH敏感蛋白質。

相反，磷酸鉀，組氨酸，三羥甲基氨基甲烷(Tris)和檸檬酸鹽緩沖液在冷凍期間顯示出最小的pH變化。此外，低緩沖液濃度可有助于降低pH變化。組氨酸是一種氨基酸，有效pH范圍為5.5-7.4，它與生物pH相容，并且經(jīng)常用于冷凍干燥的蛋白質。然而，選擇適當?shù)睦鋬龈稍锼灾苿?，包括緩沖劑，取決于蛋白質的要求及其給藥途徑。

2、填充劑

為了保證冷凍干燥后形成良好的配方結構防止產(chǎn)品塌陷，同時改善配方溶解性，冷凍干燥保護劑中還需要加入填充劑。首先，填充劑在復溶時應該是充分可溶的并且與制劑中的蛋白質藥物相容。此外，它們沒有毒性問題并且具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可有效提高冷凍干燥效率。

甘氨酸和甘露醇經(jīng)常用作凍干蛋白質制劑的填充劑。甘氨酸在用作填充劑時具有優(yōu)勢，因為它是無毒的。它具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可實現(xiàn)高效冷凍干燥和高溶解度。

甘露醇具有與甘氨酸相同的優(yōu)點，并且對特定蛋白質藥物如LDH和轉化生長因子-b1具有穩(wěn)定作用，其穩(wěn)定效果取決于其濃度。因此，在選擇填充劑時，應仔細考慮穩(wěn)定效果以及粉餅外觀。大多數(shù)氨基酸容易結晶并且可以潛在地用作填充劑以穩(wěn)定蛋白質，然而，酸鹽的形成阻礙了它們的結晶。NaCl是另一種結晶劑，但其共熔溫度(Teu)相對于其他填充劑的而言太低，因此不推薦使用。

對于填充劑，應考慮退火步驟。甘氨酸和甘露糖醇在冷凍干燥過程中應以結晶形式存在。但是在冷凍步驟期間，過冷卻誘導兩種填充劑以無定形形態(tài)凍結，容易導致粉餅塌陷。另外，在沒有退火的情況下，填充劑可以在初級干燥期間重結晶造成西林瓶破裂，特別是當制劑中包含高濃度的甘露醇時。填充劑應在非晶相的玻璃化轉變溫度(Tg’)和填充劑的共熔溫度(Teu)之間進行有效結晶，而退火時間取決于填充劑濃度及其性質。對于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm時，推薦在-20或-25℃和2小時。

3、穩(wěn)定劑

糖類是凍干蛋白質制劑中***的賦形劑，因為它們的結構中具有許多羥基，因此可以通過取代蛋白質和水之間的氫鍵來提供穩(wěn)定效果。此外，大多數(shù)糖在正常冷凍干燥條件下不結晶，導致凍干蛋白質制劑更快速復溶。還原性糖通常不用于冷凍干燥，因為它們通過美拉德反應與蛋白質反應，然而，當它們的穩(wěn)定性效果優(yōu)于其他賦形劑時，它們可以使用。

蔗糖已廣泛用于蛋白質制劑配方，海藻糖被認為是比蔗糖更優(yōu)異的凍干保護劑，因為它具有更高的玻璃化轉變溫度(Tg’)。海藻糖還具有其他優(yōu)點，例如低吸濕性，不存在內部氫鍵，從而與蛋白質的氫鍵更靈活，化學反應性低。蔗糖和海藻糖的高粘度也可降低在高于玻璃化轉變溫度(Tg’)的溫度下干燥期間的蛋白質變性速率，從而提高冷凍干燥效率。

多元醇廣泛用于蛋白質穩(wěn)定劑，因為它們可以通過其羥基穩(wěn)定蛋白質。多元醇已被用作冷凍保護劑和凍干保護劑。例如，在凍融期間，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保護。

聚合物已被用作蛋白質溶液和凍干制劑的保護劑。血清白蛋白是用于蛋白質藥物開發(fā)的較廣泛使用的聚合物之一，作為凍干保護劑和冷凍保護劑。許多上市蛋白質藥物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有與血源性病原體相關的潛在污染物，限制了其在蛋白質藥物制劑中的使用。因此，建議rHA替代血清白蛋白。最終，建議在沒有白蛋白的情況下開發(fā)蛋白質藥物。